Elastase

Zur Hervorhebung der beschriebenen Eigenschaften die Kästchen

. anklicken. An jeder Stelle können die Bilder mit der Maus bewegt werden - wenn die Orientierung für weitere Schritte völlig daneben ist, führen zurückliegende breite

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Die Atomkoordinaten für dieses Skript stammen aus den PDB-Einträgen 1hax, 1haz und 1hb0.

Reaktions-Zwischenstufen bei der Proteolyse durch Elastase

Theorie: Das zu spaltende Peptid wird im Enzym nicht-kovalent in einer Furche in der Nähe der katalytischen Triade gebunden. Das Schema unten zeigt den Reaktionsablauf: Im ersten Schritt greift die Hydroxylgruppe von Ser¹⁹⁵ nucleophil die Amidbindung des Substrates an und bildet einen Ester. Der carboxylterminale Teil des Substrates wird dabei freigesetzt. Die aminoterminale Seite des Substrates ist kovalent an das Enzym gebunden. Im nächsten Schritt abstrahiert His⁵⁷ ein Proton von einem Wassermolekül, dessen übrigbleibender OH^--Teil sich an den Ester-Kohlenstoff anlagert. Dadurch entsteht die Oxyanionen-Zwischenstufe.

Die Röntgenstrukturanalyse: Das Heptapeptid menschliches beta-Casomorphin-7 (BCM7) ist ein schlechtes Substrat für Elastase, es wird nur langsam gespalten. Deswegen war es möglich, die Zwischenstufen der Reaktion bei niedrigen Temperaturen zu fassen und ihre molekulare Struktur zu ermitteln. Das Esterstadium war die erste sichtbare Zwischenstufe

, in der die vier aminoterminalen Reste des BCM7 an die Elastase gebunden waren. Eine Nahansicht des Reaktionszentrums zeigt die Esterbindung

mit dem Carbonyl-Sauerstoff in Wasserstoffbrücken-Abstand zu den Stickstoffatomen von Ser¹⁹⁵ und Gly¹⁹³ in der Proteinkette

. Der Ester-Kohlenstoff ist perfekt planar sp²-hybridisiert

. Außer den Wasserstoffbrücken zu Ser¹⁹⁵ und Gly¹⁹³ in dem "Oxyanion hole"

wird das Substrat durch zusätzliche Wasserstoffbrücken zu einem Strang im Enzym gehalten

, sodaß ein antiparalleles beta-Faltblatt um das Substrat erweitert wird.

Für die weitere Reaktion entreißt His⁵⁷

einem Wassermolekül

eines seiner Protonen, sodaß das jetzt freie Elektronenpaar des Sauerstoffs das Substrat angreifen kann. In der daraus resultierenden Intermediärverbindung mit dem Sauerstoffanion

wechselt die Elektronenhybridisierung für den Ester-Kohlenstoff

von der planaren sp²- zur tetraedrischen sp³-Konformation (mit der Maus kann man das Molekül so drehen, daß es gut zu sehen ist!). Die Zwischenstufe wird etwas stabilisiert, indem die negative Ladung der drei Sauerstoffatome über die Sauerstoffalle auf der einen Seite und gegenüber

unter Vermittlung eines Wassermoleküls auf Thr⁴¹

verteilt wird. In diesem Zustand sind die Wasserstoffbrücken des BMC7 zu dem beta-Faltblatt des Enzyms gegenüber der Ester-Form etwas gedehnt

. Das erleichtert die Dissoziation des gespaltenen Substrated von dem Enzym, sobald die Bindung zu Ser¹⁹⁵ gelöst ist. Experimentell wird der Wechsel von der Esterzwischenstufe zu der tetraedrischen Form durch eine geringfügige Erhöhung des pHs erwirkt. Nach Zusatz von weiterem Alkali schreitet die Reaktion schnell fort und in der nächsten Stufe wird das Enzym ohne Substrat gefunden

.
Was passiert mit der dritten Aminosäure der katalytischen Triade, Asp¹⁰²? Diese Asparaginsäure gelangt nie in Bindungsabstand zum Substrat. Trotzdem hat diese Aminosäure eine wichtige Rolle: sie ist Teil eines Wasserstoffbrücken-Netzwerkes (zu dem katalytischen His⁵⁷ und dem Faltblatt-bildenden Ser²¹⁴) und generiert das elektrostatische Potential des Reaktionszentrums

.
Einen Eindruck des gesamten Enzyms bei der Proteolyse gibt die raumfüllende Ansicht

RC Wilmouth et al, X-ray snapshots of serine protease catalysis reveal a tetrahedal intermediate, Nature Struct. Biol. 8 (2001) 689-694
G Katona et al, X-ray structure of a serine protease acyl-enzyme complex at 0.95-Å resolution, J. Biol. Chem. 277 (2002) 21962-21970