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http://www.biologie.uni-hamburg.de/
lehre/bza/neuro/1ewk/dmglurem.htm

	206			344			478			522			592			840
extrazellulär														transmembran			intrazellulär
ligandenbindend											Cys- reich
u		l			u			l

Die Ligandenbinderegion (LBR) wurde in einem Insekten-System exprimiert und das Proteinfragment kristallisiert. Nur dieser Teil des Rezeptors wird hier gezeigt. Eine intermolekulare Disulfidbrücke verbindet die Cysteine¹⁴⁰ der beiden Ketten des Dimers miteinander. Die LBR kristallisierte als Dimer, aber die Abschnitte der Aminosäuren 125-153 sind in beiden Strängen ungeordnet und daher in der Röntgenstrukturanalyse nicht sichtbar  . Die Disulfidbrücke ist daher hier auch nicht sichtbar und das Bild erweckt den falschen Eindruck der Unabhängigkeit der Proteinketten.

Das Bild hier zeigt das Protein parallel zur Membran gesehen - der nächste Knopf schaltet zu einer Ansicht entlang der Symmetrieachse des Dimers  .

Die Ligandenbinderegion ist deutlich in zwei Subdomänen unterteilt  , wobei die Aminosäurekette dreimal die Subdomänen wechselt  . Das Glutamat wird in einer tiefen Furche zwischen den Subdomänen gebunden . Zum Glutamat gibt es polare Kontakte von mehreren Aminosäuren aus der oberen Domäne  . Zwei Wassermoleküle sind an einem Wasserstoffbrücken-Netzwerk beteiligt  . In dieser Proteinkette ist das Glutamat nur an die obere Subdomäne gebunden, die Furche ist zu weit, um Kontakte zur unteren Domäne zu ermöglichen. Die "Wolke" zeigt hier die Oberfläche von Aminosäuren im Abstand von ca. 6 Å von dem gebundenen Glutamat.

In der anderen Proteinkette sind die Verhältnisse anders. Bei genauem Hinsehen bemerkt man eine Abweichung von der Symmetrie im unteren Teil des Dimers. Die Furche ist deutlich schmaler, sodaß das Glutamat auf beiden Seiten Kontakt zum Protein ausbilden kann  . Zur oberen Domäne sind die Kontakte genauso wie in dem anderen Molekül, aber zu der anderen Seite gibt es genausoviele Bindungen  .

Konsequenz: Es gibt zwei verschiedene stabile Konformationen in dem Homodimer  . Die untere Domäne (zur Zelloberfläche gewandt) ist in der geschlossenen Konformation gegen die obere Domäne um 31° gekippt im Vergleich zu der offenen Konformation. Die Domänen selbst ändern ihre Struktur nicht, lediglich die Aminosäuren in der Gelenkregion haben verschiedene Bindungswinkel. Am deutlichsten ist das bei Gly⁴⁷⁷ und Arg⁴⁷⁸  .

Bei Kristallisation des Proteins ohne Glutamat ergibt sich dieselbe Struktur, wobei die Glutamatbindestelle frei bleibt. Je nach verwendetem Puffersystem ergeben sich Strukturen der freien Form I oder II. In der freien Form I ist die Proteinkette wie in der Glutamat-gebundenen Form mit der weiten Furche gefaltet, aber die Lage der Monomeren unterscheidet sich bezüglich der Symmetrieachse.
Die Disulfidbrücke zwischen den Cys¹⁴⁰ kann aufgrund der flexiblen Schlaufen ihrer Umgebung das Dimer nicht stabilisieren. Der Zusammenhalt der Dimere wird stattdessen durch Wechselwirkung zweier Helices-Paare bewirkt  . Die gepaarten Helices sind fast parallel innerhalb einer Proteinkette. Die Paare sind im Dimer um 70° gegeneinander gekreuzt, was keine sehr feste Bindung aneinander ermöglicht  . Dieses gilt für den Glutamat-Komplex und die freie Form II. In der freien Form I ist der Winkel zwischen den Helices-Paaren 140°. Das ergibt auch keine stärkere Bindung der Dimeren zueinander, vergrößert aber den Abstand der unteren Domänen zueinander.

Die Existenz verschiedener Konformere (unabhängig von Ligandenbindung und sogar innerhalb eines Homodimer-Kristalls) wird als dynamisches Gleichgewicht der Formen interpretiert. Der Übergang zwischen den Formen wird durch die ehr schwache Bindung der Helixpaare aneinander begünstigt. Die Bindung des Liganden führt sowohl zu einer Verschiebung des Gleichgewichtes als auch zu einer Stabilisierung des Komplexes mit der engen Furche (mit der festeren Bindung des Glutamates). Einen ähnlichen Mechanismus gibt es bei einem bakteriellen periplasmatischen Bindeprotein (LAOBP für Lysin/Arginin/Ornithin-Bindeprotein), das eine ähnliche Struktur aufweist.

Beide Domänen der LBR des Glutamat-Rezeptors haben eine alpha/beta-Topologie. In der der Zelloberfläche zugewandten Domäne dominiert ein achtsträngiges beta-Faltblatt  , neben dem Helices verschiedener Länge liegen. Hier gibt es auch eine Disulfidbrücke (benutzen Sie die Maus, um sie zu finden!)  .
Die gemischte beta-Strang-Topologie ist in diesem Schema wiedergegeben:

In der von der Zelloberfläche abgewandten Domäne gibt es neben dem großen Faltblatt ein weiteres kleines und einige Helices  . Drei Disulfidbrücken stabilisieren diese Domäne durch Vernetzung von Schlaufen.

Das Protein ist nicht so "hohl" wie es in dieser Darstellung erscheint. Eine Überlagerung der Elektronenwolke gibt einen Eindruck des besetzten Volumens  .

Solange die Strukturdetails der übrigen Teile des Rezeptors noch nicht bekannt sind, können auch noch keine Aussagen zur Weitergabe der Signalerkennung durch die Glutamatbindung an das gekoppelte G-Protein gemacht werden.

Literatur:
N Kunishima et al, Structural basis of glutamate regognition by a dimeric metabotropic glutamate receptor, Nature 407 (2000) 971-977